有些友谊可以超越一辈子。贝利找到命中注定的主人，他们之间牢不可破的羁绊，将他和牠所爱的人带往想像不到的地方。

贝利（再度由乔什．盖德献声）在密西根的农场跟牠的“男孩”伊森（丹尼斯．奎德饰）及妻子汉娜（玛格．海根柏格 饰）过著幸福快乐的日子，甚至还有了新玩伴：伊森和汉娜的小孙女CJ。问题是CJ的妈妈葛洛莉亚（贝蒂．吉尔平饰）决定将她带走。在即将转世前，贝利答应伊森找到CJ，并不惜一切代价保护她。贝利接下来开启了几段充满爱、友情和奉献的生命冒险旅程，与CJ（凯瑟琳．普雷斯科特饰）和她最好的朋友崔特（刘宪华饰）共同经历欢笑、音乐与泪水，还有不时撒娇摸肚肚。

贝利始终没有忘记和伊森的约定，不论历经几次投胎转世，不管换过多少名字，贝利仍不停地寻找著CJ。牠凭著熟悉的味道，还有敏锐的观察力，还是在每次轮回中找到CJ，更想尽各种办法想要靠近并留在她身边，牠陪著她历经长大，走过失恋的伤痛、渡过梦想路上的挣扎期、看著她和葛洛莉亚努力修复母女关系……

《一条狗的使命2》不单提到嗅癌犬，还把此放进剧情里，助川特及早发现癌细胞，接受治疗。

另外一个就是动物收容的议题，就像志工无奈的跟CJ说的，现况就是认养速度比不上弃养速度，收容所迟早会满，经过各种现实层面的考量，来排序给无人认养的狗狗安乐死，遗憾又无奈的作做，点出了动物收容这条路的艰困与难关。